一、为什么需要进行抗原–抗体分子对接？

在前面的教程中，我们已经利用MOE完成了CNTO607–IL-13复合物的结构准备、CDR注释、结合界面分析以及抗体理化性质计算。

这些分析主要基于已知的抗原–抗体复合物结构。

然而，在实际抗体研究中，我们经常只能获得抗体和抗原各自的三维结构，而缺少两者结合后的实验复合物结构。

例如，通过抗体同源建模或AlphaFold等结构预测工具，可以获得抗体的三维结构；同时，也可能从PDB数据库或其他结构预测方法获得抗原结构。

但即使已经知道两个蛋白质各自的结构，我们仍然无法直接确定：

1. 抗体主要结合在抗原的哪个区域？

2. 抗体以什么方向和角度接近抗原？

3. 哪些CDR可能参与抗原结合？

4. 两个蛋白质之间是否能够形成合理的结合界面？

蛋白质–蛋白质对接（Protein–Protein Docking）就是用于研究这些问题的重要计算方法。

其基本思想是：在给定两个蛋白质三维结构的情况下，搜索它们可能的相对位置和空间取向，并通过一定的评分方法筛选潜在的结合构象。

在抗体设计中，这些预测结果可以为抗原表位识别、关键结合残基分析以及后续抗体突变优化提供结构参考。

二、蛋白质–蛋白质对接与小分子对接有什么区别？

小分子对接通常是将一个小分子配体放置到蛋白质的结合口袋中，搜索不同的平移、旋转和内部构象，并利用评分函数评价预测结果。

但蛋白质–蛋白质对接存在一些不同的特点。

对于抗体–抗原对接，虽然抗体的结合区域通常集中在可变区的CDR附近，但抗原表位的位置可能并不明确。

因此，如果直接对整个抗原表面开展搜索，可能产生大量候选结合构象。

而且，抗体本身也可能存在一定的构象柔性，特别是CDR-H3等环区，其构象变化可能对抗原识别产生影响。

这些因素都会增加蛋白质–蛋白质对接的计算难度。

三、MOE如何进行蛋白质–蛋白质对接？

MOE的Protein–Protein Docking通过构象搜索和能量评价，预测两个蛋白质可能形成的结合构象。

其核心流程可以概括为三个步骤。

3.1 粗粒化表示（Coarse-grained Representation）

由于蛋白质通常包含大量原子，如果在构象搜索的每一步都进行完整的原子级能量计算，计算成本可能非常高。

因此，MOE采用粗粒化表示方法，将蛋白质中的原子信息转换为数量更少的计算单元（Beads）。

在该方法中，一个氨基酸残基可以使用1–3个粗粒化Beads表示，并赋予相应的范德华及电荷参数。

这样可以在保留部分关键物理特征的同时减少计算量，使较大规模的构象搜索成为可能。

需要注意，粗粒化并不意味着忽略原子间相互作用，而是利用简化后的表示方法近似计算蛋白质之间的作用。

3.2 刚体构象搜索（Rigid-body Docking）

在刚体对接中，两个蛋白质的内部构象保持不变，主要搜索它们之间不同的平移和旋转方式。

MOE使用快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform，FFT）等方法进行构象搜索，能够在较大的空间范围内生成大量候选结合姿态。

每一种候选结合姿态通常称为一个Pose。

搜索过程中，蛋白质可能以不同方向接近对方，并形成不同的接触界面。

因此，对接输出通常不是一个唯一结构，而是多个候选复合物构象。

3.3 构象优化与评分

生成候选Pose后，MOE会进一步使用更精细的能量模型对构象进行优化和筛选。

其评价会涉及范德华相互作用、静电相互作用和溶剂化等能量项。

例如，GB/VI（Generalized Born/Volume Integral）是一类隐式溶剂模型，可以用于近似描述溶剂环境对分子能量的影响。

通过逐步优化和评价，MOE最终输出一组经过排序的候选结合构象。

需要强调，Protein–Protein Docking的评分只能作为候选构象筛选依据，并不等同于实验测得的结合自由能。

此外，刚体对接主要考虑蛋白质之间的相对位置变化，难以充分描述较大的蛋白质构象重排。因此，当真实结合过程涉及显著的CDR或抗原构象变化时，预测结果可能存在偏差。

四、抗体–抗原对接为什么需要CDR约束？

在普通的蛋白质–蛋白质对接中，如果不知道具体的结合位置，通常需要搜索较大范围的蛋白质表面。

但对于抗体，我们已经具有一定的先验知识。

抗体通常通过VH和VL组成的可变区识别抗原，而六个CDR是抗原结合区域的重要组成部分。

因此，可以在对接时利用CDR信息，对抗体的候选结合区域进行限制。

这种方法被称为结合位点约束（Site Restraints）。

其作用是减少明显不符合预期的结合方式，使搜索更加集中于可能具有生物学意义的区域。

例如，如果一个预测Pose主要依赖Fab恒定区与抗原结合，而完全没有利用可变区，那么对于常规抗原结合型抗体而言，这种姿态通常需要谨慎评价。

引入CDR约束能够帮助减少此类不合理构象。

不过，需要注意以下两点：

• CDR约束并不代表六个CDR都必须直接接触抗原，也不意味着Framework残基完全不能参与结合。

• CDR约束主要提供抗体侧结合区域的信息，并不等于已经知道抗原上的准确表位。

因此，CDR约束属于辅助对接搜索的先验信息，而不是对真实结合方式的实验确认。

五、使用MOE进行CNTO607–IL-13对接

本篇继续使用PDB 3G6D。

由于3G6D已经包含CNTO607与IL-13的实验复合物结构，我们可以利用它开展一个具有已知参考构象的对接案例。

在本次计算中，使用其中抗体和抗原各自的结构进行对接搜索，最终可以将预测Pose与实验结合构象进行比较。

这种方法属于基于结合态结构的对接验证练习（Bound-state Redocking），它有助于学习对接操作与评价方法，但不能直接代表对未知抗原–抗体体系的预测能力。

步骤1：加载并准备3G6D复合物

在MOE中打开：

MOE | RHS | Open

选择：

3g6d.pdb.gz

或者打开之前已经完成结构准备的复合物文件。

如果从原始PDB重新开始，应按照第一篇教程完成QuickPrep结构预处理。

接下来，点击MOE主界面的SEQ按钮，打开Sequence Editor，并使用：

SEQ | Annotate | Antibody | IMGT

对抗体进行CDR注释。

完成后，MOE可以识别抗体重链、轻链、抗原及对应的CDR区域，并在System Manager中形成相应的结构分组和残基集合。

本次对接主要涉及：

这里需要特别注意：用于对接的抗体不仅仅是一条重链，而是由Fab中的重链和轻链共同组成的结构。

步骤2：启动Protein–Protein Docking

在MOE主菜单中选择：

MOE | Protein | Protein-Protein Dock...

随后会打开Dock面板。

在面板左侧选择：

Protein-Protein

进入蛋白质–蛋白质对接设置界面。

在这个界面中，可以定义参与对接的两个蛋白质，以及对接位点、搜索约束、构象优化与输出文件等参数。

步骤3：定义Receptor与Ligand

在蛋白质–蛋白质对接中，我们通常需要确定两个计算对象：

• Receptor：在对接搜索中作为相对固定参考的蛋白质。

• Ligand：相对于Receptor进行位置和方向搜索的蛋白质。

对于本次CNTO607–IL-13案例，设置为：

Receptor：Antigen

Ligand：Antibody

即将IL-13设置为Receptor，将CNTO607设置为Ligand。

这里的Ligand不一定是小分子，在蛋白质–蛋白质对接中，它也可以是一个完整的蛋白质或蛋白复合物片段。

将抗体定义为Ligand，主要是为了在对接过程中搜索抗体相对于抗原的不同结合姿态。

步骤4：设置结合区域

在Dock面板中找到：

Site

点击下拉菜单，选择已建立的：

Antigen

集合。

该设置用于指定当前对接操作中的相应位点集合。不同版本或不同结构注释状态下，可用的集合名称可能有所不同，因此需要确认Antigen集合确实对应IL-13，而不是仅依赖名称进行判断。

对于真实的未知表位体系，如果已有抗原结合区域的实验信息，也可以考虑进一步限定抗原侧的候选结合位置。

但本篇主要学习CDR约束对接，不额外引入未经验证的抗原表位限制。

步骤5：启用CDR Site Restraints

在Protein-Protein面板中找到：

Antibody: Auto-detect CDR Site Restraints

勾选该选项。

这一功能用于自动识别抗体CDR相关的结合区域约束，从而辅助进行抗原–抗体对接。

在当前示例中，Ligand Site区域还可以显示CDR相关的位点集合，例如CDR_H3。

需要注意，Ligand Site中的具体选项与Auto-detect CDR Site Restraints的自动约束设置需要分别检查。不能仅凭显示了CDR_H3，就认为全部CDR都具有相同约束，也不能直接认定只有CDR-H3参与真实结合。

步骤6：检查对接方法及输出设置

在同一个对接面板中，可以看到：

Refinement：Rigid Body

该选项表示当前使用刚体形式进行相关的构象优化。

在刚体优化过程中，主要调整蛋白质之间的相对位置和取向，不对蛋白内部的所有构象自由度进行充分搜索。

对于本次示例，可以保留该设置。

随后，在Output区域指定结果文件，例如：

dock.mdb

MDB是MOE使用的分子数据库格式，可以保存多个候选结构及相应的计算结果。

为了避免覆盖已有数据，也可以根据个人的文件管理习惯使用其他名称，例如：

CNTO607_IL13_dock.mdb

建议每次对接计算使用独立的结果文件，以便后续进行比较和复现。

步骤7：运行蛋白质–蛋白质对接

检查参数设置后，点击：

Run

MOE将启动Protein–Protein Docking计算。

对接过程中，程序会搜索不同的抗体结合位置和空间取向，并逐步筛选候选构象。

由于蛋白质–蛋白质对接需要搜索较大的构象空间，因此通常比简单的小分子局部结构优化消耗更多计算资源。

具体计算耗时会受到蛋白质大小、搜索参数及计算机性能等因素影响。

六、蛋白质–蛋白质对接会产生什么结果？

6.1 为什么会得到多个Pose？

在对接计算过程中，抗体可以通过不同的方向和角度接近抗原。

每一种候选结合姿态都可以表示为一个Pose。

这些Pose之间可能存在以下差异：

1. 抗体结合在抗原的不同表面区域。

2. 抗体结合位置相似，但相对旋转方向不同。

3. 抗体识别的局部区域接近，但接触残基及界面构象存在差异。

因此，Protein–Protein Docking通常会输出多个候选结构，而不是只生成一个最终答案。

程序可以根据相应评分对结果进行排序，但评分靠前的Pose并不一定就是实验中的真实结合构象。

6.2 对接结果保存在哪里？

计算完成后，MOE会将结果写入指定的MDB数据库。

例如：

dock.mdb

该数据库可用于后续的构象浏览、评分比较及界面分析。

如果尚未完成实际计算，也可以使用MOE示例目录中提供的预计算数据库：

$MOE/sample/mol/3g6d_dock.mdb

这一示例数据库包含20个经过筛选和重新聚类的候选Pose，可用于后续的结果分析练习。

需要注意，这20个Pose是该示例数据库的内容，并不意味着每次对接计算都一定输出20个结构。

步骤8：打开对接结果数据库

使用：

MOE | RHS | Open

选择生成的dock.mdb文件。

如果使用已有的示例结果，则打开：

3g6d_dock.mdb

随后MOE会启动Database Viewer，显示对接计算生成的结构记录和相关字段。

步骤9：初步浏览对接构象

在Database Viewer中选择：

DBV | File | Browse

打开Database Browser。

在浏览面板中，可以选择包含分子结构的mol字段，查看不同的候选Pose。

如果使用3G6D预计算示例，可以通过浏览按钮依次切换不同的结合构象。

此时可以初步观察：

• 抗体是否位于IL-13表面合理的结合区域。

• 不同Pose之间的结合方向是否存在明显差异。

• 抗体的可变区是否朝向抗原。

• 是否存在显著的空间冲突或不合理的结合方式。

本篇暂时不对所有Pose进行详细评分或结构比较，主要确认对接计算已经生成可供后续分析的候选复合物。

七、如何理解CDR约束对接的优势与局限？

对于抗体–抗原体系，CDR约束可以提高对接搜索的针对性。

然而，引入约束并不意味着对接结果一定正确。

首先，抗体真实的结合方式可能涉及多个CDR和部分Framework残基，过于严格的约束可能限制真实结合构象的搜索。

其次，当抗体或抗原在结合前后发生明显构象变化时，刚体对接可能难以准确描述这种变化。

此外，如果抗原表位未知，即使已经限制抗体侧的CDR区域，仍然可能在抗原表面形成多种不同的候选结合模式。

因此，在实际应用中，可以根据已有信息选择不同的对接策略：

对于CNTO607–IL-13，本次具有实验复合物作为参考，因此适合进一步开展预测结构与实验结构之间的比较。

但需要区分：使用结合态结构进行Redocking，与仅凭未知复合物的两个独立结构预测结合模式，并不是难度完全相同的任务。

如果抗体在结合前后发生较大构象变化，真实的未知结合模式预测可能更加困难。

因此，对接结果需要通过多种结构信息进行综合评价，而不能只依据排名选出一个Pose。

八、常见问题

Q1：为什么已经有3G6D复合物，还需要重新对接？

本篇使用3G6D主要是为了建立可验证的教学案例。

通过已知实验复合物，可以在后续分析中比较预测Pose与实验结构之间的差异，从而理解对接方法的预测能力和局限性。

Q2：Receptor和Ligand可以交换吗？

在概念上，两个蛋白质都可以作为对接对象，但Receptor和Ligand的设置决定了程序如何处理固定参考结构、移动对象及相关位点约束。

因此，交换两个对象可能改变搜索设置和结果，尤其是在使用特定Site或CDR约束时。

在本篇案例中，建议保持Antigen作为Receptor、Antibody作为Ligand。

Q3：为什么CDR注释后仍然找不到CDR约束？

需要检查抗体链是否被正确识别，以及Sequence Editor中的抗体注释是否已经完成。

此外，还需要确认用于对接的抗体结构包含正确的重链和轻链，并检查Site或Ligand Site下拉菜单中的可选残基集合。

Q4：为什么不同次运行得到的对接构象可能不同？

对接搜索的结果可能受到初始结构、搜索参数、约束设置、采样策略及软件版本等因素影响。

因此，比较不同计算结果时，应记录所使用的结构和计算条件。

Q5：对接排名第一的Pose是否就是最合理的结合结构？

不一定。

评分较高的Pose可能在当前评分模型下具有较有利的相互作用，但不一定与真实结合构象一致。

还需要结合CDR参与情况、界面接触、空间冲突、构象聚类以及已有实验信息进行进一步评价。

九、本篇小结

本篇以CNTO607–IL-13复合物为例，介绍了MOE Protein–Protein Docking的基本原理和实际操作流程。

我们首先了解了蛋白质–蛋白质对接与小分子对接之间的区别，以及粗粒化表示、FFT构象搜索和能量评分的基本思想。随后通过MOE设置抗原和抗体的对接对象，使用CDR Site Restraints辅助结合构象搜索，并将计算结果保存到MDB数据库中。

通过这些操作，我们获得了多个可供进一步分析的候选抗原–抗体复合物构象。

需要注意，Protein–Protein Docking主要提供可能的结合模式，其预测结果仍然需要进一步评价和验证。

下一篇预告

MOE抗体的理性设计教程（07）：如何评价抗原–抗体对接结果？结合构象排序与结构比较

下一篇将继续使用CNTO607–IL-13的对接数据库，介绍如何通过Database Viewer浏览候选Pose，并结合实验复合物结构、RMSD及界面接触等信息，对不同的预测结合构象进行比较和评价。